CTAB Yöntemiyle Bitkilerden Hızlı ve Ucuz DNA İzolasyon

graiv
words in dictionary

CTAB tamponunuzu başlamadan önce 65oC’de ısıtın.

Havanlarınızı iyice steril ettikten sonra ya buz üzerine koyun yada 10 dk kadar -20oC bekletin.

10 örnek için 6 ml alın ve üzerine 60 µl Merkaptoetanol’ü  çeker ocağın altında ekleyin.

  1. 50-100 mg sıvı azotta toz hale getirdiğiniz bitki örneklerinizi havana koyun ve üzerine 600µl CTAB ekleyin ve iyice ezdikten sonra eppeondorf tüplere alın.
  2. Örnekleri vorteksledikten sonra  65oC sıcaklıkta su banyosunda 30 dk bekletin.
  3. Su banyosundan çıkardığınız örneklerin üzerine 600 µl klorofrom ekleyin ve iyice vorteksleyin.
  4. +4oC 14.000g de 2 dk santrifüj edin.
  5. Dikkatli bir şekilde üst sıvıyı başka bir eppondorf tüpe aktarın.
  6. Üzerine 450 µl İzopropil alkol ( Isopropanol ) ekleyin ve karıştırın (daha fazla izopropil alkolü dafa fazla nükleik asitleri çökertmesi için opsiyonel olarak -20oC de 30 dk bekletebilirsiniz).
  7.  +4oC 14.000g de 15 dk santrifüj edin.
  8. Tüpün dibinde pelleti görmeniz gerekecek. Eğer hiç bir şey görünmüyor ise bir yerde hata var demektir.
  9. 600 µl   %70’lik ethonel ekleyip elinizle 30 sn kadar tüpü çalkalayın.
  10. +4oC ‘de 14.000 g de 3 dk santrifüj edin.
  11. Üst sıvıyı dikkatlice dökün (Pellet sıvı ile akabilir).  
  12. 90 µl DNA/RNA Free  yada depecle mualeme edilmiş ddH2O otaklavlanmış su ekleyin.
  13. 15 dk. 65oC su banyosuna koyun ve pelleti suda çözün.
  14. 5 dk yüksek hızda santrifüj edin.
  15. Üst sıvıyı temiz bir ependorf tüpüne koyun. Böylede kullanabilirsiniz. Bu aşamadan sonra RNA ve DNA içerir.  Ancak RNA dan ari olmasını istiyorsanız, 1 µl RNAse enzimini 30 dk 37oC de inkübe edin.

Kaynak : Untergasser A. “DNA Miniprep using CTAB” Untergasser’s Lab. Summer 2008. (include here the date when you accessed these page).
<http://www.untergasser.de/lab/protocols/miniprep_dna_ctab_v1_0.htm>.