Malondialdehyde yani kısaca MDA enzim analizi özellikle bitkilerde stres çalışmalarında bakılması gereken önemli parametrelerden bir tanesidir. Bilindiği üzere stres gibi çevresel etmenlerden kaynaklı hücre membran lipidlerinin lipid peraksidasyon ile yıkılması sonucu malondialdehyde ürün olarak açığa çıkar. MDA bu sayede lipid hasarının ortaya çıkarılmasında önemli bir gösterge olarak karşımıza çıkar.
Analiz için gerekli kimyasallar,
- Trikloroasetik Asit (TCA) (Molekül ağırlığı : 163.39) Sigma Ürün No: T6399
- Tiyobarbitürik Asit (TBA) (Molekül ağırlığı : 144.15) Sigma Ürün No: T5500
- Butil Hidroksi Toluen (BHT) (Molekül ağırlığı : 220,65) Sigma Ürün No: B1215000
- Saf ethenol (etil alkol) (Molekül ağırlığı : 46,07) ) Sigma Ürün No: 32205
- ddH2O (ultra saf su)
300 mg taze yaprak örnekleri %80’lik 3 mL soğuk ethonolde homojenize edilir. Ekstrakt 3000xg hızda +4oC’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Alınan süpernatant ikiye bölünür;
- 1 ml Etkrat + 1 ml %20’lik TCA (Trikloroasetik Asit) + 1 ml %0,01’lik BHT (butylated hyroxytoluene) eklenir (-TBA).
- 1 ml Etkrat + 1 ml %20’lik TCA (Trikloroasetik Asit) içerisinde çözülmüş % 0,65’lik TBA (tiyobarbitürik asit) + 1 ml %0,01’lik BHT (butylated hyroxytoluene) eklenir (+TBA).
A ve B şeklinde hazırlanan karışımlar ependorf tüplere aktarılarak 95oC’de 25 dakika inkübasyon edildikten hemen sonra buza alınarak ani soğuması sağlanır. Soğuyan karışım 3000xg hızda +4oC’de 10 dakika yeniden santrifüj edilir. A ve B şeklinde hazırlanan karışımlardan süpernatant alınır. 470, 532 ve 600 nm dalga boyunda absorbansları ölçülür. Malondialdehyde (MDA) analizi aşağıdaki formüle ile hesaplanacaktır.
1- ((ABS 532+TBA)-(ABS 600+TBA)-(ABS 532-TBA)-(ABS 600-TBA)= X
2- ((ABS 440+TBA)-(ABS 600+TBA)x0,0971=Y
3- nmolMDA/ml= (X-Y/157000)x106
Kaynak : https://link.springer.com/article/10.1007/s004250050524