Bitkilerde Prolin Analizi

graiv

Bulundurmanız Gereken Malzemeler

  • Prolin
  • Ninhidrin
  • Glacial acetic acid
  • Ethonol (%98)
  • Saf su
  • Eppendorf Tüp
  • Blok ısıtıcı yada su banyosu
  • Santrifüj
  • mikroplate
  • Mikroplate Spektrofotometre

Prolin içeriğini – μmol g-1 FW  cinsinden hesaplayacağız.

Bitkilerde bulunan prolin sıcak yada soğuk yöntem kullanarak ekstrakte etmek mümkündür.

  1. 50mg taze yaprak örneği alınır ve %70 lık 1ml ethonol:su tamponu ile havanda iyice ezildikten sonra eppendorf tüplere alınır.
  2. Bir gece +4oC’de bekletilir.
  3. 14000 g ‘’de  5 dk santrifüj edilir.
  4. Süpernatant (üst sıvı) dikkatlice yeni tüplere alınır ve 20 yada 50 kat seyreltilir.
  5.  1-0.4-0.2-0.1-0.04 mM olacak şekilde prolin standartları hazırlanır.
  6. Rekasiyon karışımı hazırlamak için acetic acid 60% (v/v), ethanol 20% (v/v) içerisinde ninhydrin 1% (w/v) çözülür.
  7. 100 μl reaksiton karışımı üzerine 50 μl prolin ekstrakı yada 50 μl sırasıyla hazırlanan prolin standartı tüplere eklenir.
  8. 95oC blok ısıtıcı yada su banyosunda 20 dakika bekletiltikten sonra oda sıcaklığında soğumaya bırakılır.
  9. Santrifüjde 2500rpm de 1 dakika santrifüj edilir
  10. Üst sıvıdan 100 μl alınarak mikroplate aktarılır
  11. Mikroplate okuyuculu spektroda 520 nm dalga boyunda absorbans değerleri okutulur.

Kaynak : Carillo, P., & Gibon, Y. (2011). Protocol: extraction and determination of proline. PrometheusWiki.