Başlamadan önce her zaman dediğim gibi literatüre iyice bir bakın. Bazı durumlarda farklı bitkiler için farklı ezme tamponları kullanılmaktadır. Genel olarak benim kullanmdığım ezme tamponunun hazırlanmasını anlatacağım. SOD, CAT, APX, GPX, POD ve PPO enzim aktivitelerini belirlemede aynı tamponu kullanabilirsiniz. Öncelikle 100mM (pH 7,5) k-fosfat tamponunuz hazır bulunmalıdır. Nasıl hazırlandığını bu yazımızda bulabilirsiniz.
Kimyasalların farklı yapıda olanları olabilir bu yüzden molekül ağırlıklarını kontrol ederek işe başlamanızı öneririrm. 0,5gr 1 örnek için 3 ml ezme tamponu kullanılmaktadır. buradan size gereken tampon karışımını hesaplıyabilirsiniz.
Eğer farklı mollerde karışım hazırlamanız gerekiyor ve hesaplamada sıkıntı çekiyorsanız molarite hesaplama için tıklayınız.
Gerekenler
100mM K-fosfat pH 7,5 (Hazırlanışı için tıklayınız)
0,5 mM EDTA (Molekül Ağırlığı : 372.24 gr/mol)
1mM askorbik asit (Molekül Ağırlığı : 182,08 gr/mol) (Apx enzim ölçümü yapılacak ise)
%1-2 Polivinilpirolidon (PVP) (özellikle POD ve PPO aktivite ölçümlerinde eklenmeli).
Hazırlanışı (250 ml’lik ezme tamponu için)
1. 0,0186 gr EDTA’yı 250 ml 100mM K-fosfat tamponu içerisine içerisinde çözünüz.
2. 0,0046 gr askorbik asit ekle.
3. Son olarak %1’lik istiyorsan 2,5 gr PVP tartıp karışımın üzerine ekleyerek manyatik karıştırıcı ile iyice karıştırınız.
4. 0,5 gr bitki örneğinizden soğutulmuş yada buz içerisindeki havana koyup hazırladığınız tampondan 3 ml üzerine ekleyip iyice eziniz.
5. Karışımı tüplere alıp 10,000x g 4 °C de 20 dk santfürüj edin.
6. Süpernatandı (üst sıvı) temiz bir tüpe aktarıp hemen ölçüm yapacaksanız +4oC’ye yada -20oC
de saklayınız.
Not: Katalaz çabuk bozulur. Bu yüzden buzla çalışmayı ihmal etmeyin. Çok fazla örneğiniz varsa aynı süpernatantı iki yada bir kaç tüpe dağıtarak devamlı olarak çözülüp yeniden donmasından dolayı oluşacak bozulmaları en aza indirmiş olursunuz.